纳米二氧化钛\\(粒径<100nm\\)具有超微性,紫外吸收性和高效光催化活性三大特性,这些特性与它的生物学特性密切相关。随着纳米二氧化钛在生活生产中的广泛运用,人们不可避免的接触到含纳米二氧化钛的物品,纳米二氧化钛可以通过吸入、摄食、皮肤渗透和注射等途径进入机体,过去的一段时间认为它是没有毒性的,并作为阴性对照进行粉尘的体内和体外研究。纳米级的颗粒通过吸入途经进入机体后,不同粒径的颗粒沉积在肺的不同位置,肺泡的巨噬细胞具有识别清除抗原性异物,参与和促进炎症反应过程,对肿瘤和病毒感染等靶细胞的杀伤作用,专职的抗原提呈细胞,启动特异性免疫应答和免疫调节等作用。

TiO2-NPs通过呼吸道进入体内首先与肺泡巨噬细胞接触,从而可能产生各种健康效应。凋亡指的是细胞在受到刺激之后启动的程序性死亡,是细胞产生的一种保护性措施。该研究以大鼠肺泡巨噬细胞NR8383作为研究对象,探讨不同粒径的二氧化钛纳米颗粒对巨噬细胞凋亡的影响。

1、材料与方法

1.1主要材料NR8383大鼠肺泡巨噬细胞由中山大学馈赠。二氧化钛纳米颗粒\\(TiO2-NPs\\),共四种粒径:\\(10±1.5\\)nm、\\(30±3\\)nm、\\(50±3\\)nm、\\(100±5\\)nm,纯度为99.9%,购买于北京纳辰科技发展有限责任公司;CCK-8检测试剂盒,Hoechst33258染色液,抗荧光猝灭封片液,碘化丙啶\\(PI\\)染色液均购自碧云天;F12K培养基购自北京迈晨科技;胎牛血清购自Gibco;青链霉素,HEPES购自北京索莱宝,多聚甲醛购自上海生工。

1.2方法

1.2.1细胞培养:NR8383细胞培养于含20%FBS\\(55℃灭活30min\\),1%青链霉素,1%HEPES的F12K培养基,37℃5%CO2条件下培养。

1.2.2二氧化钛纳米颗粒悬液制备:称取不同粒径TiO2-NPs50mg,分别溶于PBS,用电磁搅拌器初步混悬之后,并定容至100ml,超声振荡2h,制成500μg/mlTiO2-NPs储备染毒悬液,高压灭菌备用。使用前,超声振荡20min,将储备染毒悬液用F12K培养基逐级稀释成实验所需浓度使用。

1.2.3细胞活力\\(CCK-8法\\):将NR8383细胞以5×104个/孔,密度接种于96孔板,设三个复孔,在37℃5%CO2条件下培养24h,分别加入等体积的浓度为0.2、1、5、25μg/ml的TiO2-NPs处理NR8383细胞,48h后,每孔加入10μlCCK-8试剂,37℃5%CO2继续培养3h后用酶标仪450nm波长下检测各组细胞OD值,630nm为参考波长,进行细胞比活力分析,正常细胞为对照组,培养基组为空白调零孔。

活力比\\(%\\)=\\(实验孔OD值-调零孔OD值\\)/\\(对照孔OD值-调零孔OD值\\)×100%1.2.4核形态\\(Hoechst33258染色\\):选取浓度为25μg/mlTiO2-NPs处理NR8383细胞48h后,离心收集细胞,PBS洗一次,重悬细胞,滴至干净载玻片上,尽量使细胞分别均匀,稍晾干,4%多聚甲醛避光固定15min,去多聚甲醛后,滴加Hoechst33258染色液覆盖细胞,避光染色5min,去染色液后滴加抗荧光猝灭封片液,盖上盖玻片于荧光倒置显微镜下观察,未经TiO2-NPs处理组为对照组。

1.2.5细胞周期及凋亡实验\\(PI染色\\):各浓度1、5、25μg/ml组TiO2-NPs处理NR8383细胞48h后,离心收集细胞,预冷PBS洗一次,加入1ml冰浴预冷75%乙醇中,轻轻吹打混匀,4℃固定过夜。每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶\\(PI\\)染色液,缓慢并充分重悬细胞沉淀,37℃避光温浴30min,流式细胞仪检测。

1.3统计学方法。实验数据采用统计软件SPSS18.0进行统计分析,均数比较采用单因素方差分析,多重比较采用LSD法,P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1细胞活力分析结果。如图1示,不同浓度不同粒径TiO2-NPs作用48h后,NR8383细胞活力在同一粒径下随浓度增加而增加,同一浓度下随粒径增加而降低,粒径为10nm,25μg/ml时细胞活力最大,设正常对照组细胞活力为100%。

2.2Hoechst33258染色。如图2示,经Hoechst33258染色后荧光倒置显微镜下可见发生凋亡的细胞的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,正常细胞核常呈现圆形,淡蓝色,内有较深蓝色颗粒。吞噬较高浓度TiO2-NPs后的细胞核被挤压到边缘,外周能见到吞入到巨噬细胞内部的模糊的纳米颗粒阴影边缘。从结果可以看出荧光着色致密的细胞核数量增加。

2.3细胞周期及凋亡实验。如图3示,不同浓度不同粒径TiO2-NPs作用48h后,NR8383细胞出现不同程度的凋亡。随粒径大小增加凋亡率增加,随浓度增加凋亡率也随之增加。粒径100nm,25μg/ml时,凋亡率最大,与对照组凋亡率比较均差异有统计学意义。

3、讨论

3.1细胞发生凋亡时,形态发生改变。细胞膜和细胞器保持相对完整,细胞整体皱缩,细胞核固缩,能被核染料如Hoechst33258等染色并呈现浓染,这些现象与细胞坏死时的细胞膜细胞器等结构溶解、破坏完全不同。细胞凋亡分为两条途径:一是细胞外的死亡受体途径,另一条是细胞内的线粒体途径。死亡受体途径主要是通过激活细胞内的P53,Fas,Bcl-2,NF-κB等凋亡相关基因,由肿瘤坏死因子\\(TNF\\)受体家族介导,从而进一步激活Caspase-8。线粒体途径是通过改变细胞线粒体的膜电位,细胞色素C释放,细胞内Ca2+浓度升高,pH值下降,导致Caspase-9激活。两个途径都导致效应性Caspase-3活化。

3.2巨噬细胞是机体内吞噬外来物质的第一道防线,是机体重要的防御屏障。通过呼吸道进入机体的颗粒,因粒径不同,沉积在呼吸道的不同位置,对机体造成的影响也不一样。粒径<2.5μm的细颗粒物称为PM2.5。与较粗的大气颗粒物相比,PM2.5粒径小,比面积大,活性强,且在大气环境中的停留时间长、输送距离远,因而对人体健康和大气环境质量的影响更大。跟PM2.5相比,纳米颗粒的粒径更小,比面积更大,对人体健康和大气环境质量的影响可能会更大,所以探索纳米颗粒不同粒径不同浓度进入呼吸道后,对机体组织细胞产生的影响研究是必要的。

3.3有研究表明TiO2-NPs能引起细胞的凋亡。TiO2-NPs刺激大鼠肺泡巨噬细胞之后,能引起细胞的凋亡,对细胞造成一定的损伤,这种效应随TiO2-NPs的粒径和浓度变化。该研究结果也证实了这个结论,通过实验结果分析发现,不同粒径TiO2-NPs刺激48h后,大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞活力反而增加,这可能是NR8383细胞在受到外源物刺激之后,识别并吞噬外源物,巨噬细胞增殖以便消除外来物,但是TiO2-NPs被内吞之后并不能被NR8383细胞消化最终消除。TiO2-NPs刺激48h后NR8383细胞伴随有凋亡现象,凋亡程度随粒径和浓度变化。随着TiO2-NPs粒径10、30、50、100nmNR8383细胞凋亡增加,随浓度0.2、1、5、25μg/mlNR8383细胞凋亡增加。

Kennedy,应杏秋,闫庆倩等的研究可以得知同一种物质颗粒粒径越小越容易进入细胞内。TiO2-NPs被内吞进入巨噬细胞之后,对细胞造成的损伤可能与抗氧化机制和炎症反应有关系。实验证明巨噬细胞内吞TiO2-NPs之后,相关转录因子NF-κB表达增加,它编码许多与炎症相关的炎症介质如TNF-α,IL-1b,和MIP-2等。NF-κB是核转录因子,它调控细胞的多种生理功能。在凋亡的死亡受体途径中,NF-κB在TNF,IL等的刺激下启动并调控凋亡。综合以上实验结果,NR8383细胞受到TiO2-NPs刺激后能产生凋亡,结合其他研究者的研究结果发现,这可能与NF-κB的调控作用有密切关系,具体的机制在今后的研究中还有待进一步深入的探究。

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