肝脏细胞色素 P450(cytochrome P450,CYP450)氧化酶又称混合功能氧化酶和单加氧酶,广泛存在于动物、植物、微生物的各种组织中,是负责大多数临床药物、环境致癌物、外源毒物及内源活性物质生物转化的主要酶系统,具有重要的药理、生理及病理学意义。CYP450 是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的基因超家族,由不同的基因家族和亚家族组成,其中与药物代谢关系最为密切的主要有 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1 及 CYP3A4 等。
本文综述了炎症状态对 CYP2B6 活性改变及其作用机制的研究进展。

1 CYP2B6 的功能特性

CYP2B6 是人类 CYP2B 亚家族的重要成员,广泛分布于人体肝脏、肾脏、肺、小肠、子宫内膜、支气管肺泡巨噬细胞等处,参与多种内源性和外源性物质的合成和代谢。CYP2B6 蛋白质由 491 个氨基酸组成,相对分子质量为 58 268。很长一段时期内,人们低估了 CYP2B6 在药物代谢中的重要作用。近年来,随着它的一系列特异性和灵敏度都很高的抗体被制备出来,以及大量底物的发现,人们逐渐认识到它在 CYP 家族中扮演着十分重要的角色。众多学者开始关注 CYP2B6 并进行了许多相关研究。
CYP2B6 介导了大约 8% 临床药物的代谢,其中包括如抗肿瘤药环磷酰胺、他莫昔芬,抗 HIV 感染的非核苷类反转录酶抑制剂依法韦仑,抗抑郁药安非他酮、丙咪嗪,常用麻醉药氯胺酮、异丙酚等,常用的滥用药物如尼古丁和 4-\\(甲基亚硝胺基\\)-1-\\(3-吡啶\\)-1-丁酮也是 CYP2B6 的底物。除此之外,CYP2B6 还参与了很多毒物(如农药)的代谢,是重要的外源性毒物代谢酶之一。因此,稳定的 CYP2B6活性是保障药物治疗安全有效的重要前提。
CYP2B6 是一个受遗传、环境、种族和病理状况等影响较大的 P450 酶,其在基因及蛋白水平表达上显示出较大的个体差异,导致其对许多临床药物的代谢发生较大改变,甚至出现一系列毒副作用。不同的病理状况可以影响CYP2B6 的活性和蛋白表达,其中感染和炎症对 CYP2B6的影响得到了较为深入的研究。

2 炎症状态与相关性疾病

炎症是人类疾病中最常见的病理状态。越来越多的研究表明,炎症并不是一种单一的病理状态,多种疾病的发生和发展都伴有机体的炎症状态。例如感染、肿瘤、自身免疫缺陷、2 型糖尿病、冠状动脉粥样硬化以及组织损伤等许多刺激都能诱导炎症的发生,导致体内炎性细胞因子的升高。
Liu 等报道,超过 50% 的胃癌患者体内炎性细胞因子IL-1β 表达增加,Zhao 等研究表明,皮肤癌小鼠模型中角质化细胞内 IL-1β 表达增强。临床流行病学调查显示艾滋病患者伴有体内 IL-1、IL-2、IL-6 等细胞因子的显着升高。Leinonen 等证明,2 型糖尿病患者的 CRP、IL-6 等炎性因子水平较正常对照组明显升高,后证实 2 型糖尿病的发生伴随着体内多种炎性因子的过量表达。此外,文献报道急性冠状动脉综合征(ACS)患者血中炎性因子的增高与血管内皮脱落形成循环内皮细胞高度相关。关于动脉粥样硬化(AS)的发病机制曾有脂质浸润学说、血小板聚集和血栓形成学说等,但目前也认为,AS 从发生、发展到转归的全过程就是一个慢性炎症过程,众多炎症细胞和炎性介质参与其中。

3 炎症状态对 CYP2B6 活性和表达的影响

炎症是机体最常见的一种病理状态。因此科研工作者们相继从转录及转录后水平开展了大量炎症状态对 CYP450的调节研究。20 世纪 80 年代以来,美国 Emory 大学Edward T. Morgan 教授和他的科研团队致力于研究感染和炎症反应对 CYP450 的影响。其研究结果显示,感染和炎症条件下,人、大鼠和小鼠肝脏、肾脏和脑组织的细胞色素P450 酶表达和活性改变显着。例如给小鼠腹腔注射脂多糖(LPS),LPS 能够通过细胞的表面受体激活巨噬细胞,分泌大量促炎性细胞因子,继而对多种 CYP450 亚型呈现抑制作用。给大鼠分别腹腔注射 IL-6 和 TNFγ 后,CYP2C11、CYP2E1 和 CYP3A2 的 mRNA 表达均下降。
分别以人原代肝细胞和大鼠原代肝细胞等为实验对象,用促炎性细胞因子 IL-1β 和 IL-6、TNFα 和细胞进行共孵育,发现 1A2、2A5、2B1、2B6、2B9、2B10、2C11、2C29、2E1、3A2、3A4、3A11 和 4A10 等 CYP 的蛋白表达量或活性都显着降低,其中尤以对 CYP2B6 的影响非常显着,提示炎症能使经 CYP2B6 途径药物如环磷酰胺、依法韦仑和安非他酮等的体内代谢率显着下降,消除半衰期延长,导致体内药物蓄积而发生严重不良反应。

4 炎症状态对 CYP2B6 活性影响的机制研究

研究者对炎症状态下 CYP450 活性改变的机制也进行了一系列研究,以往的研究更多地关注炎性细胞因子对CYP450 的 mRNA 表达等转录水平的影响,后来大量实验结果证实,炎性细胞因子在对 CYP450 mRNA 表达无影响的情况下,依然可以降低肝药酶活性,提示转录后修饰在此过程中也扮演了重要的角色。
4.1 NO 在炎症状态对 CYP2B6 活性改变中的作用NO 是一种不稳定的生物自由基,其生物活性最早发现于 1980 年,美国科学家 Furchgott 和 Zawadzki在一项研究中发现了一种小分子物质,具有使血管平滑肌松弛的作用,被命名为血管内皮细胞舒张因子(EDRF),后被确认为是 NO。NO 由体内一氧化氮合酶(NOS)催化,以 L-精氨酸和分子氧为底物合成。NOS 包括神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)三种亚型,感染和炎症主要增加 iNOS的表达。
CYP2B6 在大鼠肝细胞主要以 CYP2B1 形式存在,与人肝细胞 CYP2B6 的基因有 76% 的相似。笔者近年来系统研究了炎性细胞因子 IL-1β 对大鼠 CYP2B1 的下调作用及其机制。实验结果证实,IL-1β 与大鼠原代肝细胞共孵育,可显着诱导 iNOS 的蛋白表达,增加 NO 的生成,并进而使 CYP2B1 蛋白质半胱氨酸的巯基亚硝基化,易于被泛素-蛋白酶体识别而快速降解,提示 NO 和泛素-蛋白酶体系统在炎症对 CYP2B6 的影响中起到了至关重要的作用,从转录后蛋白降解的水平阐述了 IL-1β 抑制CYP2B1 的机制。
4.2 蛋白质修饰在炎症状态对 CYP2B6 活性改变中的作用1992 年,Stamler 等发现 NO 和活性氮(RNS)可以作用于蛋白质半胱氨酸的巯基(Cys-SH),生成 S-亚硝基化基团(Cys-SNO),引起蛋白质的活性与功能的改变,并首次提出了蛋白质巯基的 S-亚硝基化修饰概念。
Minamiyama 等研究发现,使用 NO 供体 NOC7 或过氧化亚硝酸盐(ONOO-)和肝微粒体共孵育,可以引起 CYP450活性降低及游离巯基的减少。Roberts 等也发现 IL-1 可以使肾小球膜细胞中产生 ONOO-,继而使 CYP8A1 和CYP2B1 的活性下降,研究者猜测是由于 ONOO-使CYP8A1 和 CYP2B1 酪氨酸残基硝基化,降低了酶的催化活性。
要深入阐明 NO 对蛋白质的亚硝基化修饰作用,需要有高灵敏度和特异性的检测方法。2001 年,美国药理学家 Jaffrey 和 Snyder 等建立了一种生物素转化的方法(Biotin switch)来进行 S-亚硝基化蛋白的检测。该方法经过不断的改进和完善,目前已得到国际公认。Benhar等成功利用该方法测定了人淋巴细胞中半胱天冬酶-3蛋白的亚硝基化修饰,并发现细胞质和线粒体中的硫氧还蛋白(thioredoxins,Trx)能够降低去亚硝基化的过程。
除了亚硝基化外,NO 和 RNS 还可以对半胱氨酸的巯基进行次磺酸化(Cys-SOH)等氧化修饰。研究显示,RNS可以使酪氨酸羟化酶的半胱氨酸次磺酸化,导致酶的活性下降。GSNO 能够对组织蛋白酶 K 的半胱氨酸进行次磺酸化修饰而改变酶的活性。2008 年,美国密歇根大学Reddie 教授等利用新合成的特异性探针化合物 DAz-1,建立了一种新的次磺酸化蛋白检测方法,为研究蛋白质的氧化修饰机制开辟了广阔的前景。
2008 年,Lee 等用 NO 供体 GNSO 与大鼠肝微粒体体外共孵育,采用 Biotin switch 法检测到经 S-亚硝基化修饰的 CYP2B1,并发现泛素化 CYP2B1 蛋白明显增加,表明 NO 能够对 CYP2B1 蛋白进行亚硝基化修饰,并促进其和泛素连接;实验还发现另一 NO 供体 NOC18 和HeLa 细胞共孵育,能够引起 CYP2B1 蛋白量下降,蛋白酶体(proteasome)抑制剂 MG132 可以明显抑制这一过程,但溶酶体酶抑制剂和 Ca2+依赖 性蛋白酶抑制剂对CYP2B1 蛋白的降解无影响,说明 NO 作用下 CYP2B1的降解通过泛素-蛋白酶体途径进行。
4.3 泛素-蛋白酶体通路在炎症状态对 CYP2B6 活性改变中的作用泛素-蛋白酶体通路(Ub-proteasome system,UPS)是除溶酶体途径、Ca2+依赖性蛋白酶途径之外的另一种细胞内蛋白质选择性降解的重要途径,这一发现获得了 2004 年诺贝尔化学奖。该通路由泛素、蛋白酶体以及一系列相关的泛素激活酶 E1、泛素结合酶 E2 和泛素连接酶 E3 组成。泛素是一种小分子球蛋白,能作为“标签”结合到其他蛋白质上,蛋白质被亚硝基化或者次磺酸化修饰后易被泛素连接酶 E3 识别,使之成为蛋白酶体水解的底物。蛋白酶体是具有多亚基和多相催化活性的蛋白酶复合体,是催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶,调节着细胞内蛋白的水平和功能。
笔者近年研究发现,单纯使用外源性 NO 供体药物NOC18 同样可以使大鼠原代肝细胞 CYP2B1 蛋白表达量下降,但降解过程比 IL-1 所致的 CYP2B1 蛋白量下降缓慢。有文献报道 IL-1 可以诱导烧伤大鼠趾长伸肌中免疫蛋白酶体的蛋白水解活性和表达。由此我们推测,IL-1 可能通过直接增强大鼠原代肝细胞蛋白酶体的活性或表达,加速了 CYP2B1 的蛋白降解。最近,我们利用特异性荧光多肽底物初步测定了 IL-1 对大鼠原代肝细胞蛋白酶体活性的影响,实验结果显示,IL-1 能提高蛋白酶体的糜蛋白样(chymotrypsin-like,CT-L)活性。另外,IL-1 能够诱导蛋白酶体重要的蛋白水解亚单位 LMP2 的表达,从而从蛋白酶体途径揭示了炎性细胞因子降低 CYP2B1 活性的机制。

5 展望

CYP2B6 是人类 CYP2B 亚家族的重要成员,近年来发现,尽管 CYP2B6 只占 CYP450 的 3% ~ 5%,但它却介导了许多临床药物的代谢。和其他 CYP450 一样,CYP2B6 的活性和表达,除了受基因多态性控制外,特殊的病理状态,如感染和炎症也会对其产生显着的影响,导致其对许多临床药物如抗肿瘤药、抗 HIV 感染的非核苷类反转录酶抑制剂和抗抑郁药等的代谢发生重大改变。因此,研究炎症对 CYP2B6 活性的影响,对临床合理、安全使用CYP2B6 底物药物具有非常重要的意义。目前许多研究证实,炎症状态可以从转录后调节水平显着降低 CYP2B6 的活性,这一改变机制涉及 NO 生成、蛋白质修饰等多种因素。进一步高度关注和持续研究炎症状态对 CYP2B6 活性的作用及机制,将为临床病理状态下 CYP2B6 底物药物的正确使用提供有价值的理论和实验依据。

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